مهندسی تالن ها به منظور تخریب اختصاصی ژن میوستاتین نشخوارکنندگان و اعتبارسنجی آن ها در سلول های بنیادی جنینی موشی

چکیده میوستاتین کنترل کننده منفی رشد عضله است. جهش¬های طبیعی که در ژن کد کننده آن در طول تکامل نژادها رخ داده است، رابطه معنی¬داری را با حجم و رشد عضله نشان می¬دهند. این جهش¬ها به دو صورت، تخریب ژن میوستاتین و یا کاهش سطح رونوشت آن، موجب ایجاد فنوتیپ "عضله مضاعف" در برخی نژادهای گاو، گوسفند و سگ می¬شوند. این یافته¬ها این فرضیه را تقویت می¬کنند که با استفاده از تکنیک¬های زیست فن¬آوری برای تخریب ژن میوستاتین، می¬توان فنوتیپ عضله مضاعف را دیگر نژادهای حیوانات مزرعه¬ای و از جمله نژادهای بومی کشور ایجاد نمود. اهداف اصلی این مطالعه عبارت بودند از: الف) توسعه روشی برای مهندسی تالن¬ها ب) ساخت یک جفت تالن برای تخریب ژن میوستاتین در گوسفند، گاو و بز و ج) تست فعالیت تالن¬های ساخته شده در سلول¬های بنیادی جنینی موشی. به این منظور روش golden-gate cloning برای ساخت تالن¬ها با اعمال تغییراتی در پروتکل آن بهینه¬سازی شد. همچنین دو ناقل پلاسمیدی جدید حاوی رنگ¬های فلورسنت mcherry و egfp جهت کلون نمودن منطقه کد کننده تالن¬ها ساخته شدند. با استفاده از ابزارهای بیوانفورماتیک منطقه¬ای در اگزون دوم ژن میوستاتین برای هدف¬گیری بوسیله تالن¬ها انتخاب گردید. این ناحیه در گوسفند، بز، گاو، خوک و موش کاملاً یکسان بود. سه جفت تالن در پلاسمیدهای متفاوت جهت هدف¬گیری این منطقه خریداری و یا بوسیله روش مذکور ساخته شد. فعالیت تالن¬هایی که برای هدف¬گیری این منطقه طراحی و ساخته شده بودند در سلول¬های بنیادی جنینی موشی مورد بررسی قرار گرفت. کلونی¬های سلولی بوسیله تکنیک high resoloution melting (hrm) جهت تشخیص جهش¬های القا شده بوسیله تالن¬ها در منطقه هدف غربالگری شدند. نتایج نشان دادند که تالن¬های مهندسی شده برای هدف¬گیری اگزون دوم میوستاتین قابلیت القای موتاسیون با کارایی بین 5 الی 35 درصدی را دارا هستند. جهت تایید این نتایج، سه کلونی که بوسیله hrm جهش یافته تشخیص داده شده بودند برای منطقه هدف توالی¬یابی شدند. به این وسیله، سه آلل حاوی جهش که هر کدام به ترتیب حاوی 7، 11 و 22 جفت باز حذف شده در منطقه هدف بودند شناسایی شدند. نتایج این مطالعه قابل تعمیم به دیگر نژادها هم هستند و لذا کارایی بالای تالن¬ها این امکان را فراهم می¬آورد تا محدودیت¬های تکنیکی برای تولید حیوانات تراریخت مزرعه¬ای به نحو بسیار چشمگیری کاهش یابد. کلیدواژه¬ها: میوستاتین، تالن، جهش زایی، هدف¬گیری ژن¬ها.